研究背景：當(dāng)前測定食品還原糖廣泛使用的測定方法主要有3,5-二硝基水楊酸(DNS)法、葡萄糖氧化酶/過氧化物酶試劑盒(GOPOD)法和熒光輔助糖電泳(FACE)法，其中NDS法和GOPOD法具有快速便捷、價格低、易操作的優(yōu)點(diǎn)。但有部分從業(yè)人員發(fā)現(xiàn)在嘗試采用DNS法和GOPOD法測定含茶多酚的還原糖體系時，茶多酚的存在可能會干擾還原糖測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
基于以上因素，本研究選取了表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、沒食子酸、原花青素和阿魏酸4種典型酚類物質(zhì)(圖1)，分別以單獨(dú)的酚類、酚類與葡萄糖共混、酚類與淀粉酶解物共混體系為樣品，研究酚類物質(zhì)對DNS法、GOPOD法和FACE法定量測定還原糖的影響，以期找到適用于多酚共存體系中還原糖的檢測方法。(結(jié)論見末尾)
一、 酚類對DNS法測定還原糖含量的影響
DNS法測定還原糖的本質(zhì)是利用氧化還原反應(yīng)原理，即3,5-二硝基水楊酸的硝基被還原糖還原為氨基顯色，而還原糖被氧化成糖酸(圖2A)。
圖2A 酚類參與DNS反應(yīng)示意圖
將單獨(dú)的酚類、酚類與葡萄糖共混、酚類與淀粉酶解物共混體系3類不同樣品體系與DNS進(jìn)行顯色反應(yīng)，結(jié)果表明，EGCG、沒食子酸、原花青素代表的3類酚類物質(zhì)都會與DNS發(fā)生顯色反應(yīng)(圖2C)且具有濃度依賴性(圖2B、圖2D、圖2E)，根據(jù)單色光吸光度具有線性加和特性，因此在線性濃度范圍內(nèi)可通過調(diào)整試驗(yàn)參比排除酚類影響。
二、 酚類對GOPOD法測定還原糖含量的影響GOPOD法的原理是葡萄糖經(jīng)過葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和過氧化氫，過氧化氫進(jìn)一步在過氧化酶的作用下，將還原性的4-氨基安替比林與酚偶聯(lián)縮合成紅色的醌亞胺類化合物質(zhì)(圖3A)。
圖3A 酚類參與GOPOD反應(yīng)的示意圖
采用GOPOD法檢測EGCG、原花青素、沒食子酸和阿魏酸分別與葡萄糖共混體系中的還原糖含量，發(fā)現(xiàn)吸光度都會顯著降低，說明4種酚類物質(zhì)參與了GOPOD反應(yīng)過程(圖3B)。而EGCG和原花青素質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，與葡萄糖相比，吸光度顯著增加(P<0.05)，這是由于高濃度EGCG或原花青素與試劑盒反應(yīng)產(chǎn)生懸濁物。因此，GOPOD法并不適用于茶食品中還原糖的直接測定。
圖3B 酚類-葡萄糖混合物與葡萄糖試劑盒反應(yīng)的實(shí)物圖
三、 酚類對FACE法測定還原糖含量的影響
FACE法的原理是還原糖與ANTS發(fā)生衍生化形成不穩(wěn)定亞胺，然后通過氰基硼氫化鈉選擇性還原亞胺形成穩(wěn)定胺，再通過聚丙烯酰胺凝膠將反應(yīng)樣品電泳分離出不同聚合度的還原糖ANTS衍生物(圖4A)。從原理上推測，多酚無醛基不能參與ANTS衍生反應(yīng)。
結(jié)果顯示，F(xiàn)ACE法能分離葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、 麥芽六糖、麥芽七糖、麥芽八糖，并且在4種酚類物質(zhì)對應(yīng)的泳道上無熒光條帶，驗(yàn)證了EGCG、沒食子酸、原花青素、阿魏酸不參與ANTS衍生反應(yīng)(圖5A)。進(jìn)一步采用不同濃度的酚類物質(zhì)與淀粉酶解物(低聚還原糖)共混，研究共混樣品的FACE熒光顯色情況，發(fā)現(xiàn)酚類-淀粉酶解物的熒光條帶分布及強(qiáng)度與對照淀粉酶解物無顯著差異，說明酚類不影響低聚還原糖的測定(圖5B、圖5C、圖5D)。因此，采用FACE法測定還原糖是科學(xué)可行的。與DNS法和GOPOD法相比，F(xiàn)ACE法還可同時獲得淀粉酶解物中低聚糖的分布情況，有助于闡釋酚類物質(zhì)對淀粉酶的酶解特性及酶解產(chǎn)物的影響。
四、結(jié)論1. 對DNS法而言，阿魏酸無影響，而EGCG、沒食子酸和原花青素能夠與DNS發(fā)生顯色反應(yīng)且呈濃度線性相關(guān)性，增加了DNS法測定的吸光度，意味著酚類物質(zhì)的存在可能會使常規(guī)DNS法測定結(jié)果偏高，建議通過更換參比進(jìn)行方法改良。2. 對GOPOD法而言，EGCG、沒食子酸、原花青素和阿魏酸均能參與酶促反應(yīng)生成顯色物質(zhì)，導(dǎo)致測定結(jié)果偏離真值，因此該方法應(yīng)用時需考慮去除體系中的酚類物質(zhì)再測定還原糖。3. 對FACE法而言，4種酚類物質(zhì)均對FACE法無干擾，且FACE法還能同時獲得低聚還原糖的分布信息，是定量測定含酚類物質(zhì)體系中還原糖含量的良好方法。
本文節(jié)選自《茶葉科學(xué)》2023年第4期，P567-575，《茶多酚對茶食品中還原糖檢測方法的影響》，作者：盛政，杜文凱，王崇崇，張博安，張海華*，杜琪珍*。
來源：中國茶葉
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